ABSTRACT

De acordo com o FRAC (Fungicide Resistance Action Commitee), quando um fungicida não é mais utilizado, em uma cultura, devido à resistência do patógeno alvo que afeta a produção eficiente de alimentos. A resistência de fungos a fungicidas pode ser classificada como qualitativa ou quantitativa. Na qualitativa ocorre a perda da efetividade do fungicida, de modo repentino e marcante, devido a presença de populações de patógenos que apresentam suscetibilidade e resistência. Na quantitativa ocorre a diminuição gradual da eficácia no controle da doença, assim como a diminuição da suscetibilidade das populações do patógeno.
	Para o monitoramento da resistência de fungos a fungicidas é de extrema importância que se analise um grande número de isolados e se utilizem técnicas de monitoramento que requerem um alto investimento e tempo (RAPOSO et al. 2015).
Um dos métodos mais utilizados para medir a sensibilidade de uma população de patógenos a fungicidas e determinar a concentração efetiva para reduzir metade do crescimento da colônia do fungo (EC50), é o método de inibição do crescimento micelial da colônia em meio de cultura (ICM) (DEKKER, 1987). Como alternativa, a sensibilidade de fungos a fungicidas pode ser avaliada através da metodologia de microtitulação colorimétrica. Esse método é recomendado pelo FRAC, já sendo empregada em diversos estudos de monitoramento de resistência (VALÊNCIO, 2017).
O método de microtitulação consiste em cultivar o fungo, em meio líquido, em poços de microplacas de poliestireno e avaliar seu crescimento sob diferentes diluições de princípios ativos por espectofotometria (LUDWING; BOLLER, 1990).
Este trabalho teve como objetivo avaliar a sensibilidade in vitro de isolados paulistas do oomiceto Phytophthora infestans, ao princípio ativo Dimetomorfe, pelo microtitulação colorimétrica.
Para a realização dos experimentos foram selecionados três isolados de P. infestans, obtidos previamente de Solanum tuberosum cultivada comercialmente nos municípios paulistas de Vargem Grande do Sul, Itapetininga e Leme. Para a obtenção do inóculo, os esporângios foram coletados adicionando 10 mL de meio líquido de ervilha, em cada placa de Petri contendo o isolado crescido em meio V8, e feito uma raspagem do micélio com lâmina descartável estéril. A suspensão de esporângios foi filtrada em gaze esterilizada e a concentração foi ajustada para 104 esporos mL-1 com o auxílio de câmara de Neubauer. 
O princípio ativo Dimetomorfe (concentração 50,00% m/v) foi utilizado nas concentrações de 0; 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3 e 10 ?g.mL-1, diluídas a partir de solução estoque dos fungicidas na concentração de 1000 ?g.mL-1.
Para avaliar a sensibilidade dos isolados ao princípio ativo, 50 ?L da suspensão de esporângios na concentração 104 foram aplicados em poços de placas de poliestireno estéreis, e a seguir foram adicionados 50 ?L das diferentes concentrações do fungicida. As diluições dos fungicidas foram distribuídas na placa em valores crescentes nas linhas e os isolados em triplicata por coluna. Em todas as microplacas continham controles negativos (50 ?L do meio de cultura de ervilha + 50 ?L de água osmose reversa autoclavada) e positivos (50 ?L da suspensão de esporângios + 50 ?L de água osmose reversa autoclavada). Os experimentos foram repetidos duas vezes.
As placas de poliestireno foram tampadas e envoltas com parafilme, para evitar a evaporação, e colocadas em mesa agitadora por 15 minutos, para homogeneizar a mistura do produto com a suspensão de esporângios. A seguir, foram mantidas em câmara de crescimento a 16°C no escuro por cinco dias. Após esse período, a leitura da absorbância foi realizada a 405 nm em um leitor de microplacas Multiskan (Thermo Fisher Scientific). As médias obtidas dos valores de absorbância para as triplicatas de cada isolado, em cada diluição do fungicida, e dos controles positivo foram subtraídas da média da absorbância das triplicatas dos controles negativo, nas respectivas diluições.
Os dados obtidos da microtitulação colorimétrica foram analisados estatisticamente pela análise da variância e comparados pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Os valores de EC50 (concentração do fungicida capaz de reduzir 50% do crescimento do patógeno) foram calculados a partir das médias das absorbâncias obtidas nas diferentes concentrações dos princípios ativos. Plotou-se a porcentagem de redução no eixo Y e a concentração dos fungicidas (µg.mL-1) no eixo X, este em escala logarítmica. A equação logarítmica de ajuste dos dados foi calculada, bem como o valor de R2 para cada isolado em cada fungicida testado. A equação das retas utilizada foi Y = -a*ln(x) + b, onde: a e b = parâmetros da equação, X= concentração do fungicida (µg.mL-1) e Y = porcentagem de redução do crescimento do patógeno. O valor de Y foi substituído por 50, em cada equação, obtendo-se a concentração do fungicida capaz de reduzir 50% do crescimento do patógeno.
Os três isolados de P. infestans apresentaram sensibilidade ao princípio ativo dimetomorfe (Tabela 1). Como pode ser observado nessa tabela todos os isolados apresentaram menor absorbância na concentração a 10 ?g mL-1. Convém salientar que, este método quantifica a massa fúngica presente no poço da microplaca e quanto menor a absorbância, menor é o desenvolvimento do fungo frente a concentração do fungicida naquele poço. Estatisticamente, entretanto, os isolados de Vargem Grande do Sul e de Itapetininga apresentaram comportamentos similares frente ao princípio ativo, a partir da concentração na concentração 0,1 ?g mL-1. Já o isolado de Leme apresentou comportamento similar a partir da concentração 3 ?g mL-1.
Os EC50 determinados para cada isolado foram: 0,012593 ?g mL-1 (Vargem Grande do Sul); 0,168819 ?g mL-1 (Itapetininga) e 0,009677 ?g mL-1. Estes valores podem indicar que o isolado de Leme é mais suscetível ao Dimetomorfe que os demais isolados, mas de qualquer modo estes valores obtidos são mais baixos do que aqueles encontrados na literatura nacional (0,03 a 1,46 ?g mL-1) para esse sistema P. infestans x Dimetomorfe (OLIVEIRA 2010). Isto pode indicar que os isolados de P. infestans podem estar se tornando mais sensíveis ao Dimetamorfe.
Uma aplicação prática do método de microtitulação colorimétrica é fornecer a informação estratégica para o produtor se os isolados de fungos presentes na cultura são sensíveis aos fungicidas que está empregando para o controle do fungo alvo. Além disso, está é uma técnica que fornece um resultado rápido e a baixo custo para ser utilizado como ferramenta para manejo de doenças fúngicas.

Tabela 1. Médias das absorbâncias obtidas nas diferentes concentrações de dimetomorfe para isolados de Phytophthora infestans e EC50 obtido por isolado.

Concentração
[?g mL-1]	Vargem Grande do Sul	Itapetininga	Leme
0	0,1861 a	0,0911 a	0,2127 a
0,01	0,1589 a	0,0847 ab	0,1331 b
0,03	0,1118 b	0,0727 abc	0,0956 c
0,1	0,1031 bc	0,0557 bcd	0,0786 cd
0,3	0,0853 bc	0,0485 cd	0,0641 cde
1	0,0796 bc	0,0418 cd	0,0593 de
3	0,0717 bc	0,0353 d	0,0551 de
10	0,0586 c	0,0286 d	0,0403 e
			
CV%	15,07	20,79	13,4
			
EC50	0,012593	0,168819	0,009677
CV% = Coeficiente de variação em %; EC50 = Concentração do fungicida capaz de reduzir 50% do crescimento micelial do patógeno.